普瑞文献 | 单细胞转录组揭示哮喘加重期肺部关键免疫状态

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10月8日,郑州大学第一附属医院张国俊老师的研究团队在学术期刊Journal of Allergy and Clinical Immunology (IF: 10.228)上,发表了题名为“Single Cell Transcriptomic Analysis Reveals Key Immune Cell Phenotypes in the lung of Asthma Exacerbation”的学术论文。研究者利用BD Rhapsody 单细胞测序平台,针对哮喘患者和健康人的支气管肺泡灌洗液(BALF)中分离的免疫细胞群进行了scRNA测序分析。研究发现BALF样品中单核细胞、巨噬细胞和CD8+ T细胞的数目占比明显升高,大量的严重哮喘相关基因在多个细胞亚群中存在显著的表达差异。该研究通过单细胞层面解析哮喘病程进展相关的细胞类型及其特征表达谱,为哮喘加重的临床治疗提供了一定的理论基础和指导意义。该研究中涉及的单细胞转录组测序实验由中科普瑞完成。



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背景


人的肺在密切接触外界环境中的有害化学物质和致病微生物的情况下,仍可以维持高效的气体交换。这都依赖于肺部的黏膜免疫系统保护了肺免受各种有害因素的影响。肺部结构与免疫细胞的动态调控的是维持肺部免疫稳态的重要保证。一旦这种免疫稳态被打破,就有可能导致哮喘的发生。哮喘是由多种细胞和细胞组分参与的、以气道慢性炎症为特征的异质性疾病,这种慢性炎症与气道高反应性相关,支气管哮喘如诊治不及时,随病程的延长可产生气道不可逆性缩窄和气道重塑。


哮喘加重的病因是高度异质性的,这是由异常的先天性免疫和适应性免疫共同造成的结果。目前尚不清楚在病情恶化期间肺部支持异常免疫反应的不同分子网络。已经有部分研究结果显示,哮喘加重与呼吸道病毒感染和Th1或Th17调节免疫有关。其他免疫细胞,包括巨噬细胞(Macrophages), 中性粒细胞(neutrophils),和自然杀伤细胞(NK),它们与呼吸道抗病毒免疫反应有关,在发病机制中也有牵连。此外,涉及病毒感应和干扰素产生的多种免疫途径也与疾病恶化有关。因此,目前的研究并没有全面地解析多种免疫细胞类型中的哪些关键分子和信号通路可能导致哮喘加重。



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研究方法




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研究结论


健康组和哮喘加重组分别鉴定出6,067和6,927个细胞,平均每个细胞检测到约15,668个分子,平均每个细胞检测到约5,378个分子和约2,094个基因数,在所有细胞中共检测到36483个基因。


singleR注释细胞亚型的热图展示



通过SingleR的分析,研究者细致地鉴定了多达69种不同的细胞亚型。这些细胞亚型大部分被进一步归纳为各种已知的免疫细胞类型,包括B细胞、单核细胞来源的DCs、肺泡巨噬细胞、单核细胞来源的巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞、NK细胞、CD4+ T细胞和CD8+ T细胞。有趣的是,研究者也检测到了极少量的支气管上皮细胞、造血干细胞(HSC_CD34+)和祖细胞(CMP和GMP)。


所有细胞亚群的不同组成(健康vs哮喘加重)



进一步将这些细胞定义为16个主要的细胞亚群。哮喘加重患者BALF中有5个细胞亚群数目占比显著升高,包括细胞亚群C6(macrophage: monocyte−derived:IL−4/Dex/TGFβ)和细胞亚群C7(monocyte: S-typhimurium-flagellum)。部分巨噬细胞亚群(C0)和CD8+ T细胞亚群(C1)水平也升高。

显著差异细胞亚群的不同组成(健康vs哮喘加重)



哮喘加重患者中大约50%的中性粒细胞强烈表达IL-1B。IL-18在一些细胞亚群中轻度表达,包括哮喘加重患者的巨噬细胞和单核细胞亚群。IL-27主要在C3(macrophage: monocyte-derived:M-CSF/IFNg)和C9(monocyte: anti-FcgRIIB)中表达。CCL2和CCL5主要分别由C1 (CD8+T Cells)和C14(monocyte:CD16-)表达。这些数据表明,在哮喘加重期间,大量的细胞内信号通路被激活,以调节不同的免疫细胞的行动。

显著差异细胞亚群的信号通路激活状况



对五个亚群的特征差异基因进行功能分析和注释发现,C1-a和C7 两个细胞亚群与病毒的感染免疫过程密切关联。包括“Infection by RNA virus”,“Infection of cells”和“Viral infection”在内的多个病毒感染相关条目都出现显著富集。而相比来看,C6、CX-1和CX-2这三种细胞亚群的激活程度显著低于C1-a和C7。



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讨论


该研究通过scRNA Seq对BALF样本中免疫细胞的组成比例及其分子表达谱的研究,加深了对哮喘加重患者肺部的免疫系统全局状况的了解。在哮喘研究中,识别支持哮喘加重的分子通路是至关重要的,以往的常规转录组研究对肺免疫反应的细胞和分子组成也有重要意义。但由于没有足够的工具来研究的单细胞水平的差异,其局限性很大。该研究结果以单细胞测序数据为基础,确定了在单细胞水平上参与哮喘加重发病机制的复杂分子反应网络,并通过使用IPA上游调节因子分析,经典通路富集分析和疾病与功能富集分析对这种分子调控网络进行解析。最终阐释了多种不同的免疫信号通路之间的相互作用是如何导致哮喘患者的病情恶化。 


总之,该研究为理解不同宿主免疫细胞之间复杂的相互作用在哮喘加重的结果中所起的作用提供了细胞和分子层面的解读。这些信息有助于更好理解哮喘病程发展的细胞生物学过程和分子机制,有助于临床上开发更好的更有针对性地哮喘治疗方案。



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