阐明人类复杂疾病的遗传和非遗传的致病因素是生物医学研究的主要挑战之一。近年来，全基因组关联研究（Genome-wide association study, GWAS）已经为众多复杂疾病的发病机制提供了众多的线索。而全表观基因组关联研究（epigenome-wide association studies，EWAS）与GWAS类似，都是在全基因组水平上对疾病的复杂性状进行关联分析，两者的差别在于GWAS关注于SNP位点的差异而EWAS关注于表观修饰的差异。目前，EWAS已成为筛选疾病相关甲基化位点和区域的利器。

中科普瑞作为表观星图计划（Epigenetics Atlas Project，十万人甲基化组计划）的项目执行方 ，通过与国内外基因组队列计划联动，以及与Illumina公司的战略合作，建立中国人甲基化基准数据库，为表观遗传领域研究、应用和临床检测等建立基础数据库。 

在设计实验之前，应有明确的研究目的和研究意义，并根据研究内容的不同选择合适的研究类型和样本类型。在样本量上，为了避免群体分层、混杂因素等带来的影响，EWAS研究通常还需要较大的样本量。在数据采集上，根据截面研究设计和时间序列设计，采集相应的随访数据、暴露数据和甲基化数据。最后开展数据分析和结果验证工作。

图1 中科普瑞EWAS研究方案设计

稳定的技术平台对于EWAS研究至关重要。中科普瑞EWAS研究方案选择了目前国际通用的Illumina 850K甲基化芯片作为技术平台，该平台是目前最适合EWAS研究的性价比最高的技术平台。目前，严谨的实验规划和完善的数据分析软件，可有效的避免和校正芯片的批次效应（应充分考虑实验分组、时间序列样本、技术重复样本在芯片上的位置关系）。同时，结合表观星图计划年度批次芯片配置，有效保证样本在同一批次遵循严格的标准条件进行处理和分析。

图2 Illumina 850K甲基化平台

数据分析是EWAS的核心环节。拿到数据质控后的β matrix，需考虑校正混杂因素，全血样本还应校正细胞组分。在EWAS模型构建上，应充分考虑实验设计和研究人群的特点，选择合适的模型并分析模型的灵敏度。最后，对关联结果注释，阐明该位点在研究表型或疾病中的潜在影响。

根据项目特点制定详细的分析计划也是中科普瑞甲基化分析团队顺利执行数十项大型EWAS项目的制胜法宝。

图3 EWAS关联分析技术路线

尽管Illumina甲基化芯片的结果稳定、可靠且重复性高，但通常研究者会通过“焦磷酸测序平台”验证结果的一致性，充分说明研究的数据可靠性。为了验证EWAS结果位点的显著性，研究人员通常会扩大样本验证或考虑使用相关数据库验证。

焦磷酸测序是DNA甲基化检测的“金标准”，平台误差低于5%，价格便宜，是低通量甲基化检测的理想方法。

图4 甲基化芯片与焦磷酸测序数据的相关性图