标题：Expansion of macrophage and liver sinusoidal endothelial cell subpopulations during non-alcoholic steatohepatitis progression

发表期刊：ISCIENCE（IF=6.107）

合作单位：上海市第一人民医院

研究背景与研究目的：肝非实质细胞（NPCs）在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的进展中起着关键作用。作者通过单细胞测序探索NPC的异质性，并确定导致NASH进展的NASH特异性亚群。

检测手段：BD scRNA_seq RNAseq  免疫荧光

实验对象：3高脂高糖饮食（HFD）小鼠肝脏 VS 3自由饮食取水（Chow）小鼠肝脏。

研究结论

1、健康和NASH小鼠转录异质性分析

建立高脂高果糖饮食(简称 HFD 组)小鼠模型。20 周后，HFD组的体重、肝脏重量和肝脏体积较喂食食物的组(简称食物组)显著增加(图1A)。HFD小鼠出现脂肪变性、肝细胞气球样变、小叶炎性浸润和肝纤维化，与 NASH的病理表现一致(图 1B)。从HFD (n = 3)和 Chow (n = 3)小鼠中分离肝NPC，并进行 RNA-Seq 分析。在HFD，HFD 和 Chow 之间共发现 1，613 个差异表达基因，其中 830 个基因上调，783个基因下调，包括代表 NAMs (Trem2， Gpnmb)、 HSCs(Dcn，Colla 1)、ECs (Lyve1)、DC(FLT3)和NK细胞(Xc11)的基因(图1C)。这些结果表明，在NASH进展过程中，各种类型的NPC 可能受到影响。

图1 健康和NASH小鼠转录异质性分析

为了研究不同类型的NPC及其亚群在 NASH发病机制中的确切作用，还对同一批接受RNA-Seq 处理的NPC 进行了 scRNA_seq 分析。从6只小鼠的肝脏中分离出48，272个细胞，成功测序，其中29，784个细胞来自HFD小鼠，18，488个细胞来自 Chow小鼠。根据细胞类型特异性标记基因，可将这些细胞分为 10 种不同的类型，包括ECs、T细胞、B细胞、NK 细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、粒细胞、造血干细胞及其他主要由肝细胞和红细胞组成的细胞(图 1DF)。B细胞和ECs是HFD和Chow小鼠中最丰富的细胞类型，分别占NPCs 的28.0 33.6%和25.3 29.5%(图1G和S1B)。HSC的平均比例从 Chow 组的0.2%显著升高到HFD组的0.5%，NK细胞的平均比例从5.0%降低到3.5%(图1H)。作者还发现，HFD小鼠的ECs 和巨噬细胞比例高于 Chow 小鼠。此外，HFD 组的树突状细胞明显多于 Chow 组。这些发现进一步表明，NPC，尤其是HSC、DC、ECs、NK细胞和巨噬细胞的改变可能与 NASH的发生有关。

2、NASH肝脏巨噬细胞异质性以及Itgadhi/Fcr15hi 巨噬细胞扩增研究

scRNA_seq 数据显示，肝巨噬细胞由六个簇组成(簇7、12、19、21、23、25)。在这里作者使用小提琴图展示各个聚类中的的markergene（图2A），分析发现聚类21中的大多数细胞来自HFD，与Chow小鼠相比，在 HFD小鼠中观察到该亚群的显著扩增(图2B-C和s 2B)。聚类21，23是Itgad和Fcr15高表达，但不含Trem2和Gpnmb等NAMs 标记基因(图2A)。值得注意的是，几乎所有这些Itgadhi/Fcr15hi细胞均来自HFD小鼠，这表明它们可能是与NASH进展密切相关的独特巨噬细胞亚群(图2B-C)。

通过qPCR分析，在肝NPC 中验证了HFD小鼠中Trem2、Gpnmb、Itgad和Fcr15的上调，这进一步表明，在NASH进展期间，聚类21和23的亚群扩大(图2D)。拟时序分析显示，以Top2a和Mki67 高表达为特征的分裂细胞位于轨迹路径的起点。巨噬细胞通过以Itgadhi/Fcr15hi和Trem2hi/Gpnmbhi细胞为特征的中间状态，达到Timd4hi/Clec4fhi细胞状态(图2E-G)。

接下来，作者进行了免疫荧光和流式细胞术分析，以确认肝脏中存在Itgadhi/Fcr15hi 巨噬细胞。与 scRNA_seq 的结果一致，作者发现在 NASH肝脏中，Itgadhi/Fcr15hi 巨噬细胞亚群显著扩增（2H）。此外，在F4/80+ CD11b+双阳性巨噬细胞中，HFD组的Fcr15+细胞比例明显高于Chow组(图2I)。作者的结果表明，除NAMs 外，小鼠肝脏中还出现了Itgadhi/Fcr15hi巨噬细胞亚群，两者在NASH进展期间均扩增。

图2 NASH肝脏巨噬细胞异质性以及Itgadhi/Fcr15hi 巨噬细胞扩增研究

3、NASH肝脏ECs细胞异质性以及Egrlhi 和Ly6ahi LSECs细胞扩增研究

为了进一步探索 NASH小鼠中 ECs 的异质性，作者将ECs重新聚类为 13 个亚群((图3A)。表现出D114/Msr高表达但Wnt2/Kit 低表达的ECs-1和ECs-8 被认为是门静脉周围ECs，而表现为Wnt2/Kit中高表达但D114/Msr1极低表达的ECs-0、ECs2、ECs-4和ECs- 10 可能属于中枢周围 ECs。与门静脉周围和中枢周围ECs 相比，ECs-3、ECs-5 和ECs-7的 D14/Msr1 和 Wnt2/Kit 表达中等，但Cxc110 表达独特，被视为 LSECs。如图3D 所示，HFD组LSECs 亚群ECs-3、ECs-7 比例升高，门静脉周围亚群 ECs-1、中枢周围亚群 ECs-2 比例显著降低。ECs-3 大量表达Egr1(可促进胆汁淤积性肝损伤小鼠的炎症)，以及与细胞增殖密切相关的Plk2。ECs-7 以Isg15、Ifit1、Ifit2、Ifit3、Ifi44、Ifi47 等干扰素诱导基因高表达为特征，且Ly6a 也高表达。作者通过免疫荧光证实了HFD小鼠肝脏中Egrlhi 亚群和Ly6ahi亚群的扩增(图3E-G)。流式细胞术分析显示，Ly6a+ ECs约占HFD小鼠NPC的10%，而在 Chow 小鼠中仅占 5%左右(图3I)。这些结果表明，在NASH进展过程中，Egrlhi LSECs和Ly6ahi LSECs亚群扩增。

图3 NASH肝脏ECs细胞异质性以及Egrlhi 和Ly6ahi LSECs细胞扩增研究

4、在NASH发展早期Egrlhi LSECs、Ly6ahiLSECs与Itgadhi/Fcr15hi巨噬细胞的扩增研究

HE染色，流式分析发现随着随着高脂肪高果糖饮食 8 周、16 周、32 周的延长，肝脏脂质蓄积、炎性浸润、纤维化逐渐加重，这两种改变在第 32 周时都显著增强。并且Itgadhi/Fcr15hi巨噬细胞与Egrlhi 、Ly6ahi LSECs数量与逐渐增加，相关基因分析也是如此。这些结果表明，Itgadhi/Fcr15hi巨噬细胞亚群、Egrlhi LSECs和Ly6ahi LSECs出现在NASH早期，并在病理进程中发生急剧扩张，提示它们可能参与了NASH的加重。

图4在NASH发展早期中Egrlhi LSECs、Ly6ahi LSECs与Itgadhi/Fcr15hi巨噬细胞的扩增研究

5、NASH肝脏中增强的NPC细胞通讯研究

作者发现，与 Chow 组相比，HFD 组的大部分细胞间通讯都得到极大的增强(图6A-B)。在HFD小鼠中，HSC与多种细胞类型积极沟通，在HSC和ECs之间观察到最强的相互作用。此外，在 HFD，检测到 HSC 与巨噬细胞(包括KCs、MDM和分裂细胞)之间存在较强的相互作用，同时HSC自身内部的细胞间通讯也显薯增强，Itgad、Fcr15、Egr1、Plk2、Ly6a、Ifitl、Ifit3 和Isg15与Colla1的ISG 15呈正相关(图6C-E)，表明在NASH进展过程中，HSC与Itgadhi/Fcr15hi 巨噬细胞亚群与Egrlhi LSECs 、Ly6ahi LSECs之间可能存在密切的相互作用。总之，作者的结果表明，NASH肝中NPC之间的细胞间相互作用，尤其是HSC与ECs/巨噬细胞之间的相互作用增强。

图5NASH肝脏中增强NPC细胞通讯研究

总结

作者的研究发现表明，在肝NPC 中，亚群的Itgadhi/Fcr15hi 巨噬细胞亚群与Egrlhi  LSECs、Ly6ahi LSECs 在 NASH 早期积聚，其扩展与疾病严重程度密切相关，提示这些亚群可能参与了 NASH的进展。NASH 肝中NPC之间的细胞间相互作用增强，HSC与Itgadhi/Fcr15hi 巨噬细胞亚群与Egrlhi LSECs、Ly6ahi LSECs之间发生密切相互作用，表明这些亚群可能有助于HSC的活化。作者的研究对 NASH进展中NPC的异质性提供了见解。在后续研究中，需要研究健康和患病肝脏中Itgadhi/Fcr15hi 巨噬细胞亚群与Egrlhi LSECs、Ly6ahi LSECs的功能和意义。