普瑞文献 | 人阴茎海绵体单细胞测序图谱

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文章题目Single-cell transcriptome atlas of the human corpus cavernosum
期刊:Nature Communications
日期:2022.7.25
DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-31950-9

文中单细胞测序实验由中科普瑞协助完成。

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背景

阴茎是重要的男性特有器官,除了繁衍后代,它甚至是人类文明和各个社会文化构筑的基础之一。达芬奇说过,“小兄弟它有自己的想法”,千百年来人类对于勃起本质的探索不断进行,直到1998年西地那非用于临床,神经-内皮-平滑肌的协同作用才被认为是阴茎勃起的关键。而勃起功能障碍是男性常见的性功能障碍之一,在我国40岁以上的男性发病率高达52%,随着饮食及生活习惯的改变,勃起功能障碍(ED)正在呈现年轻化的趋势,让广大患者苦不堪言。然而,过去研究者一直把阴茎海绵体当作特化的血管结构,但是其细胞组成、调控网络以及和动、静脉等血管的差别仍缺乏研究。所以,我们收集了3例勃起正常、2例糖尿病ED和3例非糖尿病ED的男性阴茎海绵体组织进行单细胞测序,期望在构建正常阴茎海绵体图谱的同时,揭示ED患者各细胞亚型的病理变化。

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图2:达芬奇:阴茎有自己的思想

分析思路

单细胞文章首先还是要对所有细胞进行聚类、降维,可以看到海绵体里面各个亚群区分度还是比较大的。

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图3:海绵体能分成7个主要亚群

作为器官单细胞图谱类文章,在分群之后,往往就要选定要进一步研究的细胞亚群。那么该如何在这么多细胞类型中进行选择呢?

一般会用3种量化方法:

  • (1)对比各个亚群在各组间占比的变化,细胞数量变化大的亚群肯定与发育过程或者疾病进展有强相关性。
  • (2)比较各个亚群在各组间的差异度(相似度),差异度大的亚群对于组织微环境整体变化的贡献度自然也就越大。
  • (3)如果整体变化程度都差不多,比如这篇文章,那么建议先分析各亚群间的细胞通讯网络,找到最强的信号源或者接收者,这类细胞往往也会具有重要的功能,值得进一步细化分析。

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图4:成纤维细胞亚群是海绵体微环境内最强的信号输出源

另外,如果上述方法的结果都不理想,不妨找一种最好做体外实验的细胞进行分析,至少后续湿实验能容易一点。

考虑到成纤维细胞是最强的信号输出源,作者又将成纤维细胞亚群分离出来,通过RNA-seq、PCR和ELISA等验证了CellChat预测的几个配体表达。然后开始进一步分析这群细胞,结果发现这群细胞还可以分为6种亚型,根据各亚型marker基因的免疫组化染色,发现不同的成纤维细胞在海绵体中具有独特的空间分布。

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图5:6种成纤维细胞亚型的基因表达特征分析

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图6:根据单细胞分析和染色结果绘制的成纤维细胞分布模式图

近年来,成纤维细胞的调控作用越来受到关注,它们不再被认为是单纯的产生细胞外基质蛋白的“脚手架”细胞。去年Turley教授团队绘制了不同器官在正常和疾病扰动状态下成纤维细胞谱系。按照这样的思路,作者将这6群成纤维细胞亚群进行了标准化命名,并进行了跨组织的比较,最终发现海绵体成纤维细胞的转录特征与心脏中的成纤维细胞最相似。

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图7:各组织器官成纤维细胞转录相关性分析

按照上述方法,作者发现FB1亚群成纤维细胞在正常人与病人中间的数量差距较大,并且这群细胞表现出肌成纤维细胞相关的特征。一般来说,海绵体平滑肌的松弛有助于充血勃起,而肌肉的收缩和纤维化会导致血窦缩小和阴茎的疲软状态。所以,猜测这群细胞的增多与ED的发病相关。接着,作者又分析各亚群成纤维细胞的调控信号,包括CellChat配体-受体预测、IPA软件的通路分析以及通路下游转录因子的富集,都提示Wnt信号在FB1亚群显著激活,其下游的几个转录因子表达在病人中也显著上升。

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图8:Wnt信号在FB1亚群显著激活

既然生信分析告诉我们Wnt信号对FB1亚群这么重要,那接下来就是利用简单的细胞实验分别激活和抑制Wnt信号,观察海绵体成纤维细胞的变化。体外实验得到了类似的结果,即Wnt激活剂让细胞在形态、生长方式和基因表达上更接近FB1亚群(肌成纤维细胞)。并且在海绵体组织培养过程中,激活Wnt也加速了组织纤维化。这些现象都提示成纤维细胞中Wnt通路的激活是海绵体组织结构破坏的重要原因,这或许可以作为将来治疗ED的药物靶点。

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细胞实验中Wnt激活与抑制

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图9:组织培养实验中Wnt激活与抑制

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