普瑞文献 | 大侦探歇洛克·福尔摩斯携手中科普瑞助力DNA甲基化定量检测

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这项研究中所有高通量甲基化测序相关实验和数据分析都是由中科普瑞协助完成的(IF:5.316)。


CRISPR基因编辑技术出现至今的短短六年多时间里已经在全球范围内得到了非常非常广泛的应用,谁家研究所里没有几个埋头搞基因编辑技术的人呢》所以至今为止发了几千篇文章自然也就不是什么稀奇的事情了。这一基因编辑系统中被广泛使用的是Cas(CRISPR-associated protein)家族蛋白中的Cas9,后来随着技术应用的广泛,更多的Cas家族蛋白纷纷投身于这一基因编辑技术中,包括SaCas9、Cas13等。


与PCR相结合,Cas13和Cas12a这两类Cas家族蛋白已被用于开发一种快速目标核酸检测系统,这种系统就是大名鼎鼎的的大侦探SHERLOCK((Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing)。


既然说到Sherlock,就得说说他的姓氏Holmes了,毕竟Sherlock和Holmes在一起才最相配嘛。


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与SHERLOCK系统相匹配,中国科学院上海植物生理生态研究所合成生物学重点实验室赵国屏院士组的王金博士等还开发了一种叫做HOLMES(one-HOur Low-cost Multipurpose highly Efficient System)的系统,这个HOLMES系统包括样本制备和基因编辑等,可用于一小时内快速检测目标DNA和目标RNA。在HOLMES中,如果反应系统中存在目标DNA,则系统内的一种Cas12a / crRNA二元复合物就会与目标DNA形成三元复合物,然后使用trans方式切割非目标的ssDNA并作为报告基因,从而激发HEX荧光,大侦探Sherlock Holmes也就找到了想要找的蛛丝马迹了。


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但是,大家还是不满足于现有系统,因为在这里PCR和基于CRISPR-Cas的靶标检测是两个独立的步骤,而且还可能需要将PCR产物与Cas检测系统混合以进行靶标检测,这样往往就会带来实际的不便利和潜在的交叉污染,毕竟,多一个环节就多一分风险啊。


几经周折,王金博士等使用Cas12b(以前叫做C2c1)来创建全新的HOLMES系统,将它升级至v2,这个全新系统可以用于检测SNP,RNA病毒,人细胞mRNA和circRNA,甚至,它还可以用于定量DNA 的甲基化程度。乖乖,真是个好东西啊! 并且在HOLMESv2中,PCR和靶标检测这两个在v1中独立的步骤在此整合到一个系统中,这就简化了操作程序并避免掉了交叉污染。


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以甲基化检测为例,我们看看HOLMESv2是如何大展身手的。大致原理如下图A。首先,王金等使用EZ DNA甲基化试剂盒对不同人类细胞系(293T、SW480、NCI-N87和MCF-7)的基因组DNA进行亚硫酸盐处理,在处理后未甲基化的胞嘧啶C会转化为尿嘧啶U,而发生甲基化的C得以保留。然后使用一对引物对覆盖了COL1A2基因启动子区的约250bp的片段进行PCR扩增,并构建克隆载体,然后进行BSP测序。


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使用HOLMESv2进行定量检测时,对于每个待检测的甲基化位点,都需要制备一条单独的标准曲线(图C),然后使用HOLMESv2来直接定量检测这一位点的DNA甲基化程度。为了综合比较HOLMESv2系统的性能,研究者同时进行了BSP克隆测序、BSP直接测序、以及使用大规模的NGS测序来检测甲基化位点,图D所示就是几种方法的比较。待检测位点M3的甲基化程度根据HOLMESv2检测结果,293T,SW480,NCI-N87和MCF-7四种细胞系分别为63.3%,81.3%,54.8%和77.1%,BSP克隆测序结果为92.3%(12/13),100%(15/15),78.6%(11/14)和71.4%(10/14),BSP直接测序结果为63.2%,63.6%,30.4%、20%和65.3%,NGS结果为81.1%,48.3%和67.3%。


从这一结果来看,HOLMESv2用于DNA甲基化检测的准确性和可靠程度均不弱于其它三种系统,并且更接近于NGS甲基化检测。


但是别忘了,我们的大侦探HOLMESv2可是一步化、短耗时就能完成许多繁琐工作的哦!从这一点上来说,它有着大大的拓展空间。


参考文献:


Barrangou R. CRISPR-Cas systems and RNA-guided interference. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2013 May-Jun;4(3):267-78.


Li, S. Y., Cheng, Q. X., Wang, J. M., Li, X. Y., Zhang, Z. L., Gao, S., Cao, R. B., Zhao, G.P., and Wang, J. (2018) CRISPR-Cas12a-assisted nucleic acid detection, Cell discovery 4, 20.

 

LX Li, GP Zhao, J Wang.(2019) HOLMESv2: A CRISPR-Cas12b-Assisted Platform for Nucleic Acid Detection and DNA Methylation Quantitation.2019.ACS Synthetic Biology.  8, 10, 2228-2237.

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