外泌体的分离
外泌体的样本来源主要有细胞培养上清、血清/血浆、尿液、腹水、乳汁、脑脊液、唾液、滑液等,其中细胞培养上清、血清/血浆、尿液是最常见的来源。如果是使用细胞培养上清,要注意细胞培养中一定不能添加 FBS。
外泌体分离方法有很多种,包括超速离心、过滤离心、密度梯度离心、免疫磁珠和商用试剂盒。但是这么多方法中,我们通常推荐选用超速离心法进行提取和分离,因为超速离心方法得到的外泌体不管是从得率还是纯度上都比较好。其他方法的特点如下:
²过滤离心:得率比较低
²密度梯度离心:步骤繁琐,得率较低
²免疫磁珠:特异性比较高,得率较低
²商用试剂盒:价格高,效果一般。分离出的外泌体电镜和粒径效果差。
超速离心法是目前价格适中、得率和纯度都能兼得的一种方法。
外泌体的鉴定
外泌体分离之后,需要经过一系列鉴定才能确定分离的是外泌体。鉴定方法从物理特征到表面分子标志物,多角度进行鉴定。
²透射电镜鉴定法:简称TEM,适合外泌体双层囊膜超微结构观察,即通常为茶托型或一侧凹陷的半球形。
²纳米颗粒跟踪分析法:简称NTA,该方法能保证外泌体原始状态、检测速度快,检测后能提供外泌体粒径和浓度信息。
²Western blot分子标志物检测:外泌体标志蛋白包括四跨膜蛋白家族,如CD9、CD63和CD81;细胞质蛋白,如肌动蛋白(Actin)和钙磷脂结合蛋白(Annexins);参与生物功能的分子,如凋亡转接基因2互作蛋白X(ALIX)、肿瘤易感基因101蛋白(TSG101)、热休克蛋白(HSP70、HSP90),以及细胞分泌的特异性蛋白。
专注组学 精准定位 用心服务 帮您实现科研价值
——