中科普瑞协助客户禾谷镰孢菌研究荣登Nature Communication

中科普瑞RNA测序产品线提供RNA测序服务，助力中国科学院分子植物科学卓越创新中心/植物生理生态研究所唐威华研究组与中国科学院上海有机化学研究所刘文研究组在国际学术期刊《Nature Communication》发表了题为"A Linear Nonribosomal Octapeptide from Fusarium graminearum Facilitates Cell-to-Cell Invasion of Wheat"的研究论文。该研究发现植物病原真菌禾谷镰孢菌在侵染小麦期间，特异诱导次生代谢基因簇fg3_54表达，合成一个以前未知的线性非核糖体八肽fusaoctaxin A，赋予镰孢菌菌丝在小麦组织内从一个细胞穿壁入侵到旁邻细胞扩展的能力。

中科普瑞非常荣幸地参与了这项卓越的研究工作，为这项研究提供禾谷镰孢菌转录组测序实验及数据分析。

禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）是一种重要的植物病原真菌，它是引起许多作物严重病害，包括小麦赤霉病、冠腐病和幼苗枯萎病，以及玉米赤霉茎腐病和穗腐病的主要病原之一。禾谷镰孢菌侵染不仅导致农作物严重减产，而且分泌单端孢霉烯类毒素，例如致呕毒素DON等，污染作物，严重危害人类和动物的健康。而且近年来受气候变化和耕作方式等影响，小麦赤霉病在全球多国的发生具有愈来愈严重的趋势。与此同时，小麦对禾谷镰孢菌的抗性资源有限，迄今为止只有PFT等少数抗病QTL基因被鉴定出来，还没有完全抗性的品种可供使用。对禾谷镰孢菌的致病分子机制的揭示将会有利于抗病设计。但限于禾谷镰孢菌侵染小麦过程复杂等因素，目前鉴定出的禾谷镰孢菌分泌产生的直接作用于寄主植物细胞并导致病害发生的毒力分子仍然很少，仅有致呕毒素DON和分泌型脂酶FGL1等少数。　　

本研究团队在前期建立小麦胚芽鞘侵染系统，显微追踪揭示禾谷镰孢菌在胚芽鞘中的菌丝扩展分为三个时期：接种后16小时为代表的小麦细胞间延伸（intercellular growth）, 接种后40小时为代表的小麦细胞内分支生长（intracellular growth）以及接种后64小时为代表的从一个小麦细胞穿壁入侵相邻细胞依次扩展（cell-to-cell invasion），进一步运用激光显微切割技术获得了禾谷镰孢菌侵染小麦胚芽鞘的过程中接种后16 小时、40 小时及64 小时这三个时期的高清表达谱（Zhang, et al. 2012 Plant Cell 24: 5159–5176）。时期特异性的真菌表达谱分析揭示禾谷镰孢菌3号染色体上以往认为不表达的相邻八个基因在侵染64小时的菌丝穿壁侵染（cell-to-cell）时期特异性表达。这八个基因串联排列，其中包含两个非核糖体多肽合成酶基因，组成一个未知产物的潜在次生代谢合成基因簇fg3_54。fg3_54以及其中单个基因的敲除突变体菌丝体外生长正常，但在侵染小麦胚芽鞘和麦穗时丧失了穿透寄主细胞间屏障的能力，被相邻细胞的细胞壁加厚所阻碍，致病力大幅下降。之后研究发现基因簇内fgm4编码b-ANK类转录因子新成员，在体外过表达后可以激活fg3_54各成员基因的转录，克服了野生型禾谷镰孢菌不能在体外产生fg3_54产物的困难。fgm4过表达菌株发酵产物分析鉴定出fg3_54编码的两个非核糖体肽合成酶NRPS5和NRPS9的装配产物是一个线性的，具有还原性C端且富含D型氨基酸的非核糖体八肽——fusaoctaxin A。丧失了fusaoctaxin A合成能力的fg3_54相关突变体侵染小麦的致病力均大幅下降，而外施化学合成的fusaoctaxin A能够恢复突变体的致病力，回复其在小麦组织内穿壁生长(cell-to-cell invasion)的能力。fg3_54基因簇同源序列存在于多个能够侵染小麦的镰孢菌，例如燕麦镰孢菌Fusarium avenaceum、黄色镰孢菌Fusarium culmorum，而其他一些缺乏fg3_54同源基因簇的镰孢菌，例如香蕉枯萎病菌Fusarium. oxysporum f. sp. cubense TR4 和梨孢镰孢菌Fusarium poae， 也不能够侵染小麦胚芽鞘。有意思的是外施fusaoctaxin A还能使香蕉枯萎病菌和梨孢镰孢菌获得侵染小麦胚芽鞘的能力。此外，初步探索显示fusaoctaxin A可能通过控制胞间连丝的开闭、抑制叶绿体光合相关活性等机制发挥作用。总之本研究发现并鉴定fusaoctaxin A是直接参与禾谷镰孢菌与小麦相互作用的新分子。

本研究同时尝试利用RNA-seq技术探寻fusaoctxin A引起小麦转录组水平的相关变化（中科普瑞公司参与该研究转录组测序实验，并协助后续的数据分析）。通过筛选本研究鉴定到一系列特异性受fusaoctaxin A影响上下调表达基因，并对上下调基因分别进行GO富集分析。分析结果显示，被fusaoctaxin A下调表达基因显著富集在叶绿体相关通路，而fusaoctaxin A上调表达基因显著富集在细胞内物质转运相关通路，这预示着fusaoctaxin A的作用位点可能定位在叶绿体，通过抑制叶绿体引发的免疫反应来达到帮助病原菌侵染的目的。同时，本课题组还进一步分析了植物抗病反应中的一些标志性基因，例如PR基因，胼胝质合成酶相关基因等。PR基因中除非特异性脂质转运基因PR14的表达被fusaoctaxin A抑制外，其他基因表达并未受到显著影响，这意味着禾谷镰孢菌侵染过程中并未明显激活PR基因的表达。然而，定位在叶绿体中的钙离子响应受体基因和定位在胞间联丝的胼胝质结合蛋白基因的表达被明显抑制，这显示fusaoctaxin A可能通过控制胞间连丝的开闭、抑制叶绿体光合相关活性等机制发挥作用。

作为目前发现的唯一线性非核糖体肽类植物致病因子，fusaoctaxin A能够帮助抑制寄主小麦的免疫防御反应，使镰孢菌菌丝在小麦中能够从一个细胞穿壁入侵旁邻细胞依次扩展（cell-to-cell invasion）。本研究进一步解析了禾谷镰孢菌侵染小麦的分子机理，补充了现有非核糖体多肽的种类及编码规则，为小麦赤霉病防治提供新靶标和新思路。

植生生态所贾雷杰博士、有机化学研究所唐昊宇博士、植生生态所博士研究生王婉秋为本论文的共同第一作者，植生生态所唐威华研究员和有机化学研究所刘文研究员为共同通讯作者。本研究得到国家自然科学基金、科技部、中国科学院先导项目、转基因专项等资助。