近年来，单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术在生物医疗科研领域蓬勃发展，解决了传统RNAseq中细胞异质性问题，在单个细胞水平上实现了对组织或器官基因表达的分析，构建了完整的单细胞转录图谱。为精细细胞亚群分群、鉴定和特征Marker基因筛选、转录因子调控通路发现，以及细胞发育轨迹、胞间通讯提供了解决方案。目前单细胞RNA测序技术已经广泛应用于人类、模式动物等的研究中。

虽然单细胞技术在植物中也有一定的应用，但是仍然存在不少挑战：

²植物细胞生存于刚性的细胞壁中，在制备单细胞悬液过程中要先从细胞壁中释放出细胞来。使用酶解液破坏细胞壁对植物来说是一种是生存胁迫，如果操作不当会引起细胞进行应激情况下的转录，会引起转录偏差。

²原生质体制备过程中会引起渗透压改变，进而原生质体大小也会发生改变。

²制备原生质体酶解配方个性化较高，不同组织之间差别比较大，并且酶解出来的原生质体很脆弱，活性波动较大。

²植物单细胞测序后生信分析也是不小的挑战，由于植物基因组研究本身存在局限性，加上植物较为重要的线粒体和叶绿体基因组研究较难，基因注释存在一定难度。

针对以上难点，中科普瑞单细胞平台在植物原生质体制备、生信分析等方面进行技术研发，并利用BD单细胞研究联合实验室，使用客户已发表的技术资源，开发了【中科普瑞植物单细胞测序解决方案】，具体包括植物原生质体制备+单细胞转录组测序以及生信分析系统解决方案、植物细胞核提取+单细胞核文库构建测序解决方案。

一、植物原生质体制备+单细胞转录组测序+生信分析

服务方案：植物原生质体制备+单细胞转录组测序+生信解决方案（使用NCBI/JGF/Ensembl等数据库注释转录组，获得Marker基因）

已成功制备原生质体的植物类型：拟南芥、玉米、大豆、水稻、小麦、烟草、杨树、荷叶、茶、火龙果、甘薯、薄荷、番茄等。

图 使用NCBI对转录组进行了基因注释和Marker gene提取

二、植物细胞核提取+单细胞核文库构建测序

本方案主要利用了华南农业大学王惠聪教授课题组近期在国际期刊《Cells》发表的单细胞核文库构建方案Systematic Methods for Isolating High Purity Nuclei from Ten Important Plants for Omics Interrogation。

该篇文章的技术方案由王惠聪教授课题组与BD Total Solution团队共同合作，利用碧迪医疗流式细胞分选仪和Rhapsody单细胞测序建库平台开发优化了10种重要植物种类的细胞核提取方法并用于单细胞核文库构建，是世界上首次针对主要农作物高纯度单细胞核的文库构建整体解决方案。单细胞核测序能够克服植物单细胞样本制备过程中的应激反应，但是植物细胞组成复杂，成功分离细胞核难度极高。本技术方案优化建立了针对不同材料的提取和纯化方法，成功解决植物单细胞测序样本单细胞核分离困难、纯度低、得率少的关键问题。通过碧迪医疗流式分选仪富集纯化得到的高纯度细胞核可以满足单细胞核建库测序及qPCR基因表达量检测，同时联合应用BD Trucount能够精确计算组织中的细胞核数量，为植物科研工作者提供了宝贵的方法参考依据。

包括的九种重要的农作物/经济作物及模式植物的叶片

水稻、玉米、大豆、番茄、葡萄、香蕉、柑橘、苹果、荔枝和拟南芥。

细胞核提取Buffer开发优化

不同种类的植物结构有较大的区别，从草本到木本植物，细胞核提取难度逐渐增大。针对不同类型植物，Buffer成份有明显差异，其中螯合剂，金属离子以及表面活性剂的含量的选择最关键。本方案根据每种植物特性开发了8种提取Buffer，可以高效的分离得到细胞核粗提液，使用BD Rhapsody Scanner扫描，可以清晰的观察到植物细胞核及组织碎片。

细胞核纯化分选

细胞核粗提液中含有大量杂质，未经纯化的细胞核溶液有强烈的自发荧光，且游离的含核酸细胞器（叶绿体和线粒体），以及未裂解完全的细胞碎片，会严重干扰后续基因扩增，单细胞建库等实验。通过BD FACSMelody分选，可以区分颗粒大小及PI的信号强度，分选的到高纯度的细胞核。

细胞核绝对计数方式

在发育及育性的研究中，细胞核计数是非常重要的测量指标，实验方案中使用BD Trucount计数管，可以对提取的细胞核精确计数，避免染色核漂洗带来的随机损失。比较了10种植物的细胞核绝对数量，并计算不同组组织与细胞核提取得率的关系，发现该细胞核计数方式稳定可靠，不同植物的细胞核得率与其干重有显著的相关性。

单细胞核测序及细胞核应用场景

提取的高纯度植物细胞核可直接用于BD Rhapsody建库，由于细胞核纯度高质量好，单细胞降维结果分群明显，通过marker基因拆分，可以清晰的看到不同的细胞群分布。此外，高质量的细胞核可以用于基因扩增和基因表达量检测等实验方案。